RT-PCR知多少有这一篇就够了

  RT-PCR就是逆转录PCR(Reverse transcription PCR)或称为反转录PCR(Reverse transcription-PCR,RT-PCR),是以RNA为材料应用于PCR扩增中的一种实验方法。首先通过逆转录酶将总RNA或信使RNA(mRNA)转录成互补DNA(cDNA)。其次Taq DNA聚合酶以cDNA为模板进行qPCR扩增。RT-PCR已被广泛应用于多种分子生物学应用中,包括基因表达分析、基因测试、RNA干扰验证检测、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。

  RT-PCR的方法之一步法和两步法RT-PCR其操作方法分为两种,即一步法和两步法。一步法RT-PCR,逆转录同PCR扩增结合在一起,即cDNA合成与PCR扩增反应在同一管Buffer及酶中进行,一步完成。两步法RT-PCR,RNA首先在反转录酶的作用下生成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增,分成两步进行。

  RT-PCR中模板的选择在RT-PCR 实验中,选择总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。mRNA虽然能提供略高的灵敏度,但总RNA经常使用,具有较mRNA更重要的优势。第一,其过程需要较少的纯化流程,这保证了更好的回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。第二,避免mRNA富集步骤,为了避免不同mRNA的回收率而带来结果偏移的可能性。总之,在大多数的应用中,目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更重要,因此在多数情况下,总RNA更适用。

  反转录酶的选择反转录酶(Reverse transcriptase)又称逆转录酶。是以RNA为模板指导dNTP合成互补DNA(cDNA)的酶。一部分反转录酶具有RNA酶活性,能够在转录后降解RNA-DNA杂交链中的RNA链。如果反转录酶没有Rnase酶活性,可加入RNaseH来获得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶。依据RT-PCR,理想的状态下是选择具有较高热稳定性的反转录酶,cDNA的合成才能在较高的温度下进行,确保成功转录具有较高二级结构的RNA,并确保在整个反应过程中的全部活性,从而得到质量更高的cDNA。

  RT-PCR引物的选择逆转录引物一般包含3种:oligo dT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。

  RT-PCR引物设计原则1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子的基因组DNA序列不会被扩增,也可减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性风险。引物选取同样需要保守。

  2. 引物长度和Tm值:引物设计长度为18-25 bp,Tm值在50-65℃之间,引物中GC含量在40-60%。设计引物时尽量避免出现4个或超过4个G碱基。

  RT-PCR实验阴性对照反转录阴性对照应包括在所有的RT-PCR的实验中,用来检测DNA是否污染(如基因组DNA或PCR产物)。该对照所指不加反转录酶,通过反转录过程得到cDNA在进行荧光定量PCR检测。如检测到扩增,则样本中可能含有基因组DNA污染。

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