PCR耗材篇(微流控芯片)

小钱对PCR领域的学习主要分三大块,包括微流控芯片、检测试剂以及仪器。而本篇是小钱对于核酸检测之PCR微流控芯片这个模块的学习分享,涉及PCR检测中的耗材,比如微流控芯片,POCT产品以及孔板等等~

引文【2】中,如图1核酸检测过程包括“提取和纯化-扩增-检测”。样本基质(血液、尿液、痰液等)含有主要“困”在真核或原核细胞或病毒颗粒中的核酸。通过涉及例如细胞裂解和核酸纯化的样品制备,为后续分析准备核酸,后续分析可能涉及DNA/ RNA的扩增和实时或端点信号检测。核酸检测是判定病毒是否感染的金标准,而核酸检测又是相对复杂的多步骤分析过程。这一过程大致可分为两部分。(一)旨在使核酸易于分析的“样品制备”。为了释放核酸,需要进行预处理步骤和随后的细胞裂解。通过纯化步骤,会对后续分析产生负面影响的物质被去除。(二)“核酸分析”,例如涉及核酸扩增步骤,如聚合酶链反应(PCR),需要在55℃至95℃之间的循环温度变化,或在恒定温度下工作的扩增技术,如环路介导等温扩增LAMP,重组酶聚合酶扩增RPA,解旋酶依赖扩增HDA或滚圈扩增RCA。最后,在放大期间(实时)或放大后(终点)将正放大转换为可测量的信号。这个信号与样品中特定核酸序列的存在、缺失或数量有关。由于样本必须首先从患者身上转移到中心实验室。进行上述工作流程,需要有PCR上岗证的人员和高端仪器,这将核酸分析的潜在应用范围缩小到集中式实验室。在时间紧迫的情况下,在进入集中实验室的途径有限或样本运输物流链不可用的情况下,需要在“护理点”进行检测。在时间紧迫的情况下提供即时诊断是发达国家即时检测的关键驱动因素,因为这些检测必须与中心实验室竞争。在资源匮乏的情况下,即时检测可能是为大多数人口提供准确诊断的唯一可能性。所以一款能集成式或一体化的核酸检测芯片,实现sample to answer的驱动因数就更加迫切。GeneSlices系列微流控芯片

引文【2】作者使用商业化的离心实时PCR热循环仪(Rotor-Gene2000,原Corbett,由德国QIAGEN公司收购)作为处理设备。对于微流体处理,硬件修改允许手动改变转子的旋转速度在6.6 Hz(默认)和增加的旋转速度27.2Hz之间。在所有实验中,PCR管的标准转子已被定制的转子所取代,该转子可以容纳每次PCR运行最多4个GeneSlices(由HSG-IMIT微流控设计&铸造服务(Freiburg, Germanyl)制作)。作者将一种等位基因特异性实时PCR方法整合到一个离心微流控现成GeneSlice上,用于并行检测7个KRAS点突变和野生型,并预先装载引物和探针。和商用化实验标准96或384孔板相比一到四Geneslices测试的灵活性降低了成本。在GeneSlice上产生结果的时间(大约2小时)比测序的时间(高达20小时)低一个数量级,并且只需要一个移液步骤就可以在开始时装载PCR主混合液和DNA样本。为了自动化人工PCR制备的劳动密集型工作流程,作者开发了一款LabDisk,可容纳两个独立的微流控结构(图5),结构含2 × 7流体均分的扩增室,将100 uL的PCR混合物(RocheLight Cycler 480 Probes Master, Roche Diagnostics,德国)和100 uL的洗脱缓冲液分配到2 × 7扩增室中,扩增室包含干燥的预储存引物、水解探针和用于pc和std的附加目标DNA。

引文【2】作者,用于在包括PCs和NTC在内的定性操作模式下检测多达六种不同的食源性病原体。如图5,特异性引物对和一个FAM标记的水解探针被移液到每个扩增室Det 1 Det 6,阳性对照pc1 – pc6扩增室分别装入一对引物、一个水解探针和相应的病原菌基因组DNA。无模板控制NTC扩增室装载所有6对引物和所有6个水解探针。(a)将100μL的洗脱缓冲液和100μL的PCR混合液装入相应的入口。(b)频率协议开始,洗脱缓冲液被运送到两个相同体积的洗脱缓冲室,而PCR混合液被分配到14个5 uL的计量室中。多余的试剂被转移到了废液池。(c)在较高的转速下,PCR主混合液进入扩增室,扩增室中包含预先储存的引物和水解探针。DNA被添加到其中一个子体积(中间腔室1)。在实现集成的上游DNA提取的情况下,中间室会洗脱磁珠表面的核酸。

引文【3】中,作者将带有预存试剂(A)的微流体盘片(GeneSlice)和兼容的转子支架(GeneSlice100 Rotor)的示意图,一个RotorGene Q中最多可容纳四个GeneSlice运行(B)。Geneslice包括用于样品和无模板控制(NTC)液体的预扩增室、用于转移预扩增产物的毛细管虹吸阀和分别用于14(sample)和1(NTC)主要腔体,等分结构将多余的液体引导到废液室中。

引文【2】作者将样品和萃取试剂移液到相应的入口(a),启动频率程序。在第一个旋转步骤中,洗脱液、裂解缓冲液和样品向外呈放射状流控,样品中的病原体被裂解(b)。结合缓冲液通过毛细管虹吸管S与裂解液合并(c)。磁珠被运送到洗涤缓冲液1 (d),洗涤缓冲液2 (e)到洗脱室(f)。纯化的DNA被释放,洗脱液通过毛细管虹吸S2 (g)转移到混合室,并与预储存的RPA聚合酶(h)混合。分成11个等量体积,并转移到流体分离的扩增室。

引文【1】中,作者详细介绍了微流体装置中的聚合酶链反应的应用方法,而且作者很用心的对微流控核酸检测的应用案例进行了详细的文献汇总,感兴趣的朋友可以查看原文献进行学习。总结:在微流控芯片中预先储存试剂及其封闭的反应环境,无需进一步手动处理, 与标准PCR和测序所需的几个反应步骤(例如凝胶分析、清理步骤和测序反应的设置)相比微流控的方法效率更高,也减少了试剂消耗以及污染风险。NTC预储存室的设计将减少操作员在填充过程中处理错误的可能性,从而提高流体功能的可靠性。3PCR检测POCT产品

图9-11是典型的三款分子POCT产品,而且设计思路也不同,雅培和赛沛的方案的都是将样品制备和信号检测模块分别在两个塑料模块进行,Xpert Xpress是将墨盒和反应管薄片装卡在一起通过流道让提取的核酸分子进入到扩增腔体管然后进行扩增以及产物的信号分析,ID NOW是直接在仪器上设计了两个模块分别完成提取和扩增(恒温法扩增实现了耗时的缩减);相比较他们两款产品,Cobas Liat PCR System这款产品显得更为另类,它像一个个软管腔体串成一个mini的实验室,采用预存液体试剂的形式,扩增所需的控温模块是通过挤压PCR反应试剂在三个拥有不同温区的腔室内来回移动来实现PCR反应所需要的温度循环。还有最近几个大号转载的苏州先达基因New ERA核酸检测解决方案,小钱也官网查看了相关的产品信。

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