植物生理指标检测方法

在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有:合成纤维素组成细胞壁;转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等;分解产物是其他许多有机物合成的原料,如糖在呼吸过程中形成的有机酸,可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸;糖类作为呼吸基质,为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用,所以是营养中最基本的物质,也是需要量最多的一类。

糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在一定范围内,颜色的深浅与糖的含量成正比,故可用于糖的定量测定。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖与己糖含量,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应),所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用蒽酮法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时,则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中,不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差,但测定单一糖类时,则可避免此种误差。

糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ,故在此波长下进行比色。

2. 葡萄糖标准溶液(100 μg/mL ):准确称取100 mg 分析纯无水葡萄糖,溶于蒸馏水并定容至100 mL ,使用时再稀释 10 倍( 100 μg/mL )。

3 .蒽酮试剂:称取 1.0 g 蒽酮,溶于 80% 浓硫酸(将 98% 浓硫酸稀释,把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中) 1000 mL 中,冷却至室温,贮于具塞棕色瓶内,冰箱保存,可使用 2 ~ 3 周。

分光光度计,分析天平,离心管,离心机,恒温水浴,试管,三角瓶,移液管( 5 、 1 、0.5 mL ),剪刀,瓷盘,玻棒,水浴锅,电炉,漏斗,滤纸。

1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 ~ 1.0 g (或干样粉末 5 ~100 mg ),放入大试管中,加入15 mL 蒸馏水,在沸水浴中煮沸20 min ,取出冷却,过滤入100 mL 容量瓶中,用蒸馏水冲洗残渣数次,定容至刻度。

将各管快速摇动混匀后,在沸水浴中煮10 min ,取出冷却,在620 nm 波长下,用空白调零测定光密度,以光密度为纵坐标,含葡萄糖量( μg )为横坐标绘制标准曲线 .样品测定取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ,同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。

溶性糖含量(%)=从标准曲线查得糖的量(μg)×提取液体积(ml)×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类,测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时,常以比活(酶活力单位/mg蛋白)表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此,测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465 nm,后者在595 nm。在一定蛋白质浓度范围内(0-100 μg/mL),蛋白质-色素结合物在595 nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1 h内保持稳定。该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量,所以是一种比较好的蛋白质定量法。

分光光度计,离心机,研钵,25 mL容量瓶1个,刻度吸管0.5 mL 2支,2 mL 1支,10 mL 试管3支。

100 mL,最后用蒸馏水定容至1000 mL。此溶液在常温下可放置一个月。

称取新鲜植物叶片0.5 g置于研钵中,加入5 mL 4o C下预冷的浓度为50 mmol/L,pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入10 mL离心管中,在4 o C冰箱中静置10 min,于15000 rpm/min下冷冻离心25 min,上清液即为过氧化物粗提液。4 o C下保存备用。

2.标准曲线 μg/mL标准曲线支试管,按下表数据配制0-100 μg/mL 血清白蛋白液各1 mL 。准确吸取所配各管溶液0.1 mL ,分别放入10 mL 具塞试管中,加入5 mL 考马斯亮蓝G-250试剂,盖塞,反转混合数次,放置2 min 后,在595 nm 下比色,绘制标准曲线 μg/mL 血清白蛋白液

吸取样品提取液0.1 mL (样品提取见各酶活测定),放入具塞刻度试管中(设两个重复管),加入5 mL 考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min 后在595 nm 下比色,记录吸光度值,通过标准曲线查得蛋白质含量。

a -测定所取提取液体积(mL ); W -取样量(g )。 叶绿素测定方法

4、 分光光度计测吸光值,三波长(649,665,470),分别对应叶绿素a 、b 和其他。空白为95%乙醇。

选择的波长不一样,计算公式就不一样,网上也有其他的波长方法,计算公式里的系数响应也有差异。

淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖,在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖,测定葡萄糖含量,根据葡萄糖含量换算成淀粉含量

糖在硫酸作用下生成糠醛,糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物,颜色的深浅与糖含量有关。在625 nm 波长下的OD值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化,故必须在反应后立即在同一时间内比色

1.仪器用具:移液枪、10ml离心管、试管、50ml容量瓶、试管架、棕色瓶(>

=500ml)、螺口瓶(>

=5

Ⅰ:精确称取0.1000g蔗糖(分析纯),于小烧杯中加水溶解,定容至100ml,加2-3滴浓H2S04,该溶液可长期保存;

Ⅱ:准确吸取1mg/ml的蔗糖标准液5ml,加水定容量50ml,得到浓度为0.1mg/ml蔗糖标准液;

蒽酮溶液:100mg蒽酮溶于50ml浓H2S04(化学纯)中,避光保存,当天配制当天使用;

3mol/L的盐酸,在沸水浴中煮沸45分钟,取出冷却,4000转/分离心15分。

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